单细胞多组学揭示三阴性乳腺癌的耐药进化机制

文章标题：Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing

期刊：Cell

影响因子：38.637

导读：三阴性乳腺癌(TNBC)是一种侵袭性亚型，占乳腺癌患者的12% - 18%。TNBC患者缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和HER2受体，因此不适合激素或抗HER2治疗。许多TNBC患者的治疗标准是新辅助化疗(NAC)，其中包括紫杉烷类(有丝分裂抑制剂)和蒽环类(DNA插入剂)的联合治疗。虽然NAC在一些TNBC患者中有效，但约有30% - 50%的患者进化出耐药性，导致总体生存率较低。一个尚未解决的问题是，抗性是由选择罕见的已有克隆引起的，还是通过获得新的基因组畸变引起的。为了研究这个问题，本文在大量外显子组测序的基础上，应用单细胞DNA和RNA测序来分析20例TNBC患者在新辅助化疗(NAC)期间的纵向样本。深度外显子组测序确定了10例NAC导致克隆消失的患者和10例治疗后克隆持续存在的患者。接下来在8例患者(4例克隆消失，4例克隆持续)中，我们进行了更详细的研究，使用单细胞DNA测序分析900个细胞，使用单细胞RNA测序分析6862个细胞。我们的数据显示，耐药基因型是NAC预先存在并自适应选择的，而TNBC患者的转录谱是通过对化疗的反应重编程获得的。

实验设计

20例TNBC患者，治疗前（NAC  0周期），治疗中（NAC 2周期），治疗后（NAC 6周期）的样本，先进行外显子测序，接下来对8例患者进行了单细胞DNA测序，单细胞RNA测序。

实验思路

实验结果

1、对NAC应答的克隆消失和突变持续

对20例（其中10例NAC化疗获益，10例NAC化疗抵抗）TNBC患者治疗前、治疗中和治疗后的样本进行了外显子测序。发现10例化疗获益的患者在治疗后未检测到突变，10例化疗抵抗患者治疗后突变残留。另外发现患者对NAC的两种不同应答:(1)克隆消失（2）克隆持续，其中克隆频率发生变化，但在治疗后的样本中仍然存在。在克隆持续患者中，大多数突变在治疗前和治疗后都被检测到，但在NAC应答中频率降低。另外也发现了一些新的突变，并发现新的突变在治疗前就存在，但频率较低。

2、使用单细胞DNA测序分析NAC治疗前后CNA演化过程

为了研究NAC对拷贝数的影响，本文进行了单核DNA测序(SNS)，对来自8例（4例化疗获益、4例化疗抵抗）TNBC患者配对纵向样本的900个单细胞进行了研究(STAR方法)。研究发现，4例化疗获益患者(P1, P2, P6, P9)在化疗前的细胞有着癌细胞的特性，但是化疗后的基本上都是正常细胞。   

 对4例化疗耐受患者 (P11, P12, P14, P15)进行分析，根据CNA的变化情况可以聚为2-5种不同的亚克隆群体。对4个NAC处理后突变依然存在的个体进行了类似分析，发现部分处理前的细胞与处理后的细胞聚在了一起，说明这些细胞基因型类似，并且对处理具有抗性。TimeScape结果展示了星号标记的克隆收到NAC处理的选择，在后期得到扩张。

3、克隆消失患者肿瘤细胞的转录程序

本研究使用单核RNA测序方法研究了应答NAC的表型进化，分析了4名NAC化疗获益患者(P1, P2, P6, P9在治疗前后样本中分离出的3370个单核的转录组。差异表达基因的聚类显示，与治疗前相比，12个已知的癌症基因，在所有克隆消失患者中都下调了。接下来进行GSVA分析，并对一组癌症特异性信号进行聚类，结果显示，以下GSVA信号在治疗前的肿瘤细胞中上调:肌动蛋白途径、CDC42RAC途径、细胞增殖、未分化癌、mTORC1信号、未折叠蛋白反应、癌症meta分析、氧化磷酸化和MYC靶标。这些基因和通路可能在克隆消失患者对化疗的敏感性方面发挥作用。

4、耐药肿瘤细胞的获得性转录重编程

对于NAC治疗产生抗性的患者群体，先根据单细胞RNA测序数据进行CNA分析，不论在治疗前还是治疗后细胞均呈现出肿瘤细胞非整倍体特性，并且治疗前后的细胞呈现出不同的表达谱特征。通过使用MAST差异表达分析了化疗后耐药肿瘤细胞中上调的基因，确定了59 275个差异表达基因。并使用GSVA识别化疗耐药肿瘤细胞的共同表型，该分析确定了耐药肿瘤细胞在NAC后，ECM降解、通过mTOR的AKT1信号、CDH1靶点、缺氧、EMT和血管生成等基因标记上调。另外使用MAST，通过对治疗后肿瘤中具有耐药基因型的肿瘤细胞与治疗前肿瘤中具有敏感基因型的肿瘤细胞进行比较，我们发现预处理肿瘤中表达部分(17%-60%)化疗耐药基因的已启动。

综上结果，三阴乳腺癌患者NAC耐药性相关基因型是先天存在的，并且因新辅助化疗的选择而适者生存，含有此类基因型的克隆在肿瘤细胞中占比随响应NAC而增大；与此同时，化疗诱导了转录谱的重编程，从而产生了耐药表型。

参考文献：

Kim Charissa,Gao Ruli,Sei Emi et al. Chemoresistance Evolution in Triple-Negative Breast Cancer Delineated by Single-Cell Sequencing.[J] .Cell, 2018, 173: 879-893.e13.

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